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Nanopore宏基因組測序6小時內精準識別下呼吸道病

下呼吸道感染是全球傳染病死亡的主要原因,導致全球每年300萬人死亡。引發感染的病原菌類型廣泛。目前檢測的金標準是細菌培養法,此方法周期長,敏感性較差。患者在此期間通常接受廣譜性抗生素治療,加劇了抗生素抗藥性的問題。如何快速診斷下呼吸道感染并實現定制治療呢?
2019年7月《Nature Biotechnology》的封面文章:《Nanopore宏基因組測序6小時內精準識別下呼吸道病原體》一文,開發了一種基于Nanopore測序的臨床宏基因組學方法,可從臨床呼吸道樣本中去除高達99.99%的宿主DNA,并能在6小時內快速識別病原體和抗生素抗性基因。

發表期刊:Nature biotechnology
發表時間:2019年7月
影響因子:31.864

材料和方法

材料:
81個已用常規培養法診斷過的樣品(包括唾液,氣管內分泌物和氣管內吸出物),其中40個樣品進行方法測試,另外41個樣品對測試方法進行優化。
測序策略:
使用Nanopore MinION測序,混測6張芯片。
 
研究思路
 

 
研究結果

1. 宏基因組測方法的檢測結果

對40個樣品宿主DNA進行去除后進行宏基因組測序,該方法的靈敏度為91.4%,特異性為100%,時間為8h。經過qPCR驗證,皂苷可以消除大約99.9%的宿主DNA。

圖1 宏基因組測試方法和優化方法的流程示意圖
 
發現了5個未被培養法檢測到的病原體:在P8中發現了卡他莫拉菌;P14中的大腸桿菌;P22和P30中的流感嗜血桿菌;P29中肺炎克雷伯菌和卡他莫拉菌。
 
表1 測試宏基因組方法和常規培養方法的結果比較

1. 宏基因組測序方法的優化
球磨的方法可以使金黃色葡萄球菌DNA含量增加21倍,因此在優化的方法中加入了球磨的步驟。
通過減少DNA酶處理步驟和清洗次數,將去除宿主DNA步驟從90分鐘縮短至50分鐘。將文庫制備過程中PCR擴增時間從6min縮短到4min。上述優化方法,將整個測序前的處理時間縮短至4h以內。
 
2. 優化方法的檢測結果
用41份疑似感染呼吸道病原體的樣品進行宏基因組測序方法的優化,發現經過皂苷處理,可以去除高達99.99%的人類DNA。
優化后的方法對下呼吸道感染病原菌檢測的靈敏度為96.6%,特異性為41.7%。從樣品到結果整個過程時間為6小時。
發現了8個樣品中常規培養方法遺漏的病原體。7個常規培養方法檢測為正常樣品,而優化的方法可以檢測多達2種以上的病原體。

 
表2 在去除人DNA和未去除人DNA條件下的革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌感染的痰液標本的人和細菌DNA qPCR定量結果

結合qPCR和特異性基因分析,確認優化后的宏基因組測序方法敏感性為100%,特異性為100%。
 
1. 抗生素抗性基因檢測
細菌培養的方法從33個樣品中,只能發現43個抗性基因,而宏基因組測序優化的方法從41個樣品中檢測出183個抗性基因。
其中有26個是培養樣品中固有的,剩余157個中有24個與表型相匹配,14個無法確認相關的耐藥性,16個基因與培養的分離株表型不匹配,但是對相關抗生素敏感,42個基因不太可能來自實驗室培養的物種,56個基因可能來源于正常菌群。

 
表3 優化方法檢測的抗性基因列表

1. 有參基因組組裝
分別對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和大腸桿菌(E. Coli)序列進行有參基因組組裝,在測序2h,經過宿主DNA消除處理, MRSA可以組裝出28條contigs;E. Coli可以組裝出83個contigs。對比結果如下表:



圖2 MRSAE. Coli基因組組裝結果


1. 時間點分析
在測序5min,經過宿主DNA消除的樣品,MRSA有1.6X的覆蓋率,可以檢測2個mecA基因。而未經過宿主DNA消除的樣品,MRSA只有0.2X的覆蓋率,且未發現 mecA 基因。

圖2 MRSAE. Coli基因組在不同條件下的覆蓋率
 

在測序20min,經過宿主DNA消除的樣品,E. Coli有5.7X的覆蓋率,可以檢測到3種抗性基因(blaTEM、dfrA17和sul1)。而未消除的樣品,只有0.06X的覆蓋率。
測序2h,經過宿主DNA消除的樣品,可以檢測到47個blaTEM、37個sulf1和21個dfrA17。而未經過宿主DNA消除的樣品只能檢測到sul1,未發現blaTEM和dfrA17基因。
圖2 MRSAE. Coli在不同條件下的抗生素基因檢測結果

 

總結
細菌性下呼吸道感染危害大,傳統的細菌培養法診斷敏感性差且太慢,不能指導早期的靶向抗生素治療。本研究開發了一種用于細菌性下呼吸道感染診斷的Nanopore宏基因組測序方法,使用皂苷有效去除99.99%的宿主DNA。通過優化實驗步驟,將檢測時間縮短至6小時。對病原體檢測的敏感性為96.6%、特異性為41.7%,并能準確檢測抗生素抗性基因。結合qPCR和特異性基因分析,特異性和靈敏度可達100%。因此Nanopore宏基因組可以快速準確地診斷細菌性下呼吸道感染,將有助于減少廣譜抗生素的使用。
 
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