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基于Nanopore測序技術的人腸道病毒組研究

研究背景

腸道病毒在維持腸道微生物組成和功能以及宿主生理和免疫方面起著重要作用。然而,由于病毒難以富集,以及目前測序讀長短的原因,人類腸道病毒的研究并不多。該研究開發了一種使用Nanopore測序,結合物理富集、逆轉錄和隨機擴增,分析人類腸道病毒的完整工作流程。

 

該研究使用ONT測序平臺直接對病毒DNA測序,或病毒核酸(DNA和RNA)擴增后使用ONT測序,獲得了更多病毒多樣性和當前數據庫沒有收錄的病毒序列。并通過直接DNA測序檢測到表觀遺傳修飾的噬菌體基因組。該方法可以應用于其他病毒學研究,包括動物腸道、土壤和水體等。該研究表明,測序技術的不斷進步和生物信息學的改進將為病毒的組成、多樣性及其潛在的重要功能帶來更多的認識。

 

研究思路



 

材料和方法
5名健康志愿者的冷凍糞便樣品(約1.5 g),使用PBS稀釋混勻,4 °C下4,500 rpm離心10 min,去除殘渣,取上清液,再在4 °C下4,500 rpm離心10 min,通過0.45 μm PVDF膜過濾,去除真核細胞和細菌細胞大小的顆粒。然后在4 °C下,180,000 ×g下超速離心3 h,將沉淀懸浮在PBS中,在37 °C下,用DNase和RNase A處理。使用病毒核酸提取試劑盒提取,獲得病毒核酸(DNA和RNA),并用無RNase水洗脫(圖1)。

圖1 富集病毒顆粒(VLPs)、核酸提取和ONT測序工作流程
 

將提取獲得的5份樣品,分別取一半進行逆轉錄后,隨機擴增,獲得DNA/cDNA。另一半原始DNA和擴增獲得的DNA/cDNA樣品分別建庫,使用PromthION混合測一張芯片。

 

研究結果

1 病毒分離、富集和測序

通過測序,擴增組獲得8.2Gb原始數據,每個樣本數據量的中位數為1.7Gb;原始DNA組獲得452Mb原始數據,每個樣本數據量的中位數為67Mb(表S1)。

 

表S1 5個體提取的DNA/cDNA總量及測序產出

 

2 ONT測序揭示的健康個體病毒組成

將擴增組數據比對到NCBI病毒數據庫。結果顯示,噬菌體家族占大多數,包括Caudovirals目(siphovirdae科, podoviridae科),Inoviridae 科和 Microviridae科,與其他研究結果一致。同時,還檢測到真核細胞CRESS-DNA病毒(Genomoviridae科)和植物RNA病毒(包括Virgaviridae 和Alphaflexiviridae)。表明個體特異性可能反應出糞便病毒群落的特性(圖2)。而未培養的噬菌體WW-nAnB菌株3在5個個體的擴增組中均被檢測到。

圖2 每個個體的病毒組成和相對豐度

 

比較擴增組和原始DNA組結果,除了個體2和5之外,擴增組中病毒的多樣性更高。此外,在5個個體中,2組中常見病毒表現出的變化,證明可檢測到的逆轉錄和隨機擴增方法存在的偏好性。

 

3 病毒基因組組裝

使用Canu對2組數據中分離出的病毒reads進行組裝,共獲得1564個contigs,每個個體的原始DNA組和擴增組的contigs中位數分別為15和347。將contigs比對數據庫,比對率很低,表明有大量潛在的新基因組。

 

將分離出的病毒reads比對回contigs,統計比對到最長contig的原始reads長度,并計算原始reads比對到contig的長度比例(圖3)。擴增組中,每個樣本中最長reads長度均大于全長contig的15%,最高可達40%。原始DNA組中,比例較高,少數reads比最終的contigs長(圖3),可能是由于Canu組裝舍棄了部分較低質量reads導致的結果。

圖3 原始reads比對到contig的長度比例

 

4 使用ONT進行病毒表觀基因組檢測

ONT測序可以直接獲得DNA堿基修飾信息。該研究分析了幾個覆蓋深度均>10X的contigs上的甲基化信息。對于唯一具有已知信息的contig (Contig00000015),在8kb基因組中共檢測到17個5mC和120個6mA甲基化位點(圖4)。此外,還發現了4個覆蓋深度>10X的contigs,在數據庫中沒有比對到近緣物種。這些contigs可能是新型病毒,具有占基因組0.3-1.8%的5mC甲基化位點,和占基因組0.7-2.5%的6mA甲基化位點。

圖4 鑒定的不同甲基化位點和識別的motif

 

總結

該研究使用ONT測序平臺直接對病毒DNA測序,或病毒核酸(DNA和RNA)擴增后使用ONT測序,獲得了更多病毒多樣性和當前數據庫沒有收錄的病毒序列。并通過直接DNA測序檢測到表觀遺傳修飾的噬菌體基因組。該方法可以應用于其他病毒學研究,包括動物腸道、土壤和水體等。該研究表明,測序技術的不斷進步和生物信息學的改進將為病毒的組成、多樣性及其潛在的重要功能帶來更多的認識。

 

參考文獻

Jiabao C. et al. Profiling of Human Gut Virome with Oxford Nanopore Technology. BioRxiv. 2020.

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