使用Nanopore和Illumina對全耐藥性肺炎克雷伯菌基因組進行測序，組裝和注釋

發布時間：2020-05-28 12:40 作者：貝納科技

本研究使用Illumina和Nanopore平臺對一株全耐藥性的肺炎克雷伯菌KP58進行測序，通過混合基因組組裝，可以獲得高質量的全基因組序列，包括1個環狀染色體和5個環狀質粒。該菌株具有多種抗生素耐藥性和毒力因子。對粘菌素的抗性與一個類似ISKpn26插入到mgrB基因中有關；對替加環素的抗性與AcrAB外排泵系統的過度表達有關。與KP58親緣關系最近的是從杭州收集的另一種臨床分離株，僅相差10個cgMLST位點。這些數據將為肺炎克雷伯菌感染的預防、診斷和治療策略提供重要指導。

發表雜志：Infection and Drug Resistance

發表日期：2020年2月

影響因子：3.12

研究背景

多藥耐藥性肺炎克雷伯菌在世界范圍內的傳播日益增加，與高死亡率的各種感染有關。本研究報道了肺炎克雷伯菌株KP58的全基因組序列，這是一種全耐藥性的肺炎克雷伯菌株，在中國對粘菌素和替加環素具有較強的抗性。

材料和方法

KP58是杭州一名89歲的患者尿液中分離培養得到，患者住院期間使用多種廣譜抗生素，包括頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、替加環素和大腸菌素。進行抗菌藥敏試驗，測定最低抑菌濃度(MICs)。采用Illumina和Nanopore技術進行全基因組測序，組裝后對基因組特征、耐藥基因和毒力基因進行綜合分析；對肺炎克雷伯菌KP58和密切相關的菌株進行基因組流行病學和系統發育分析。

主要結果

Illumina測序獲得912Mb 數據，reads質量值均在Q30以上。Nanopore MinION測序獲得76K reads，平均reads長度為9.8kb（N50 19Kb, 最長read 125Kb），測序數據量為746.5Mb; Q值為9的reads大于3K，數據量為368.8Mb。

使用混合組裝，獲得KP58的全基因組序列，包括1個環狀染色體(5.5Mb)和5個質粒(197kb，135kb，87kb，12kb和5.6kb)(圖S2)。注釋到5913個蛋白編碼基因，85個tRNA基因和25個rRNA操縱子；基因組完整性為98.62%，污染率和菌株異質性分別為0.36%和0%，表明組裝獲得的基因組質量較高。

圖S2 全基因組圈圖

注：(A)為染色體，(B)-(F)為質粒

與藥物敏感性數據一致，KP58含有多種耐藥基因，包括aadA2，rmtB，blaCTX-M-65，blaKPC-2，blaTEM-1B，blaSHV-12，blaSHV-182，qnrS1，fosA，catA2，sul2，tet(A)和dfrA14，對β-乳糖、氟喹諾酮類、酚類、磷霉素、磺胺類、四環素類和甲氧芐啶具有耐藥性。此外，對喹諾酮類耐藥決定區(QRDR)的分析還發現了靶基因的改變，包括GyrA(S83I和D87G)和ParC (S80I)的突變。

使用qRT-PCR測定了替加環素抗性相關的外排泵基因(如acrA，acrB，ramA，marA，soxS和acrAB)的表達水平，表明KP58的替加環素抗性與AcrAB外排系統的過表達有關。還發現了無質粒載體的替加環素抗性基因tet(X)。雖然分離株對mcr基因呈陰性，但它攜帶了一種類似ISKpn26的元件插入到mgrB基因中，這是一種已知的賦予粘菌素抗性的插入。

還發現了三種潛在的毒力因子，包括對aerobactin, hypermucoviscosity（高粘液性）和 yersiniabactin（耶爾森菌素）的響應。KP58被確定為ST11型，這是一種廣泛傳播的多藥耐藥K. pneumoniae克隆系，在世界范圍內造成嚴重感染。用Kaptive預測KP58的KL型(多糖膠囊和脂多糖O抗原)，為KL64。還鑒定了屬于不相容(Inc) F組[IncFIB, IncR, 和 IncFII]和ColRNAI 4個質粒的復制子。

使用垂直遺傳核心基因組SNPs和核心基因組MLST分析，評估KP58與從中國收集的416株ST11 K. pneumoniae菌株之間的系統發育關系。系統發育樹具有很高的多樣性，最具地理相關的菌株被分為相同的類群，其差異為<10個SNPs（圖1）。大多數從四川和杭州收集的分離株，含有最高比例的已知的抗生素耐藥決定因子。結果表明，與KP58關系最密切的菌株是L39_2的，另一種從杭州人糞便樣品中分離的ST11菌株，這些菌株僅有10個cgMLST位點或9個SNPs(圖2)。

圖1 ST11核心基因組系統進化樹及耐藥基因分布

圖2 KP58與克雷伯菌株之間的系統發育關系

注：（A）從中國收集的所有肺炎克雷伯氏菌ST11菌株的最小生成樹（B）與KP58密切相關的菌株的最小生成樹。

在KP58質粒中，攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaKPC-2的IncR/IncFII 質粒(134,972bp)，與中國成都分離的產生KPC-2的菌株wchkp020037的質粒pKPC2_020037具有99%的同源性和75%的覆蓋率。發現pKP58-2的骨架區含有復制和穩定質粒的基因，但缺乏共軛基因。

質粒pKP58-2上blaKPC-2的遺傳背景由Tn3-tnpA，Tn3-tnpR，ISKpn27，Tn3-ΔblaTEM-1，blaKPC-2，ΔISKpn6，korC，klcA，ΔrepB和ΔTn1721組成，幾乎與三個質粒：p3_L39、p2b2和pKPC2_020037的組成相同。

另一個IncFII型質粒(87,095bp)含有耐藥基因qnrs1、tet(A)、cata2、sul2和dfra14，已知它們分別對氟喹諾酮、四環素、酚類、磺胺類和甲氧芐啶具有耐藥性。

此外，一組由iucABCD，iutA，rmpA和rmpA2組成的毒力基因均位于IncFIB/IncHI1B質粒(197,415bp)上，而在同一質粒中未檢測到抗性基因。將這種毒力質粒命名為pKP58-1，并與NCBI GenBank數據庫中的其他質粒進行比較，結果顯示其與先前報道的三種毒力質粒具有同源性，包括pK2044（99%同源性和93%覆蓋率）、pLVPK（99%同源性和89%覆蓋率）和pVir-CR-HvKP4（99%同源性和78%覆蓋率）。此外，pKP58-1的大小小于pK2044和pLVPK這兩個質粒，但大于pVir-CR-HvKP4(178,154bp)（圖3）。

圖3 不同菌株攜帶的8種毒力編碼質粒的遺傳比較

結論

參考文獻

Ruan Z, Wu J, Chen H, Draz MS, Xu J and He F. Hybrid Genome Assembly and Annotation of a Pandrug-Resistant Klebsiella pneumoniae Strain Using Nanopore and Illumina Sequencing. Infect Drug Resist. 2020;13:199-206.

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